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जिस तरह से एक साथ उत्परिवर्तन के प्रभाव मिलकर एंजाइमेटिक गतिविधि को बदलते हैं, उसका आसानी से अनुमान नहीं लगाया जा सकता क्योंकि ये प्रभाव हमेशा रैखिक तरीके से योगात्मक नहीं होते हैं।इसलिए, सब्सट्रेट को बांधने वाले अमीनो एसिड अवशेषों के एक साथ उत्परिवर्तन के प्रभावों का लक्षण वर्णन एंजाइमों की सब्सट्रेट विशिष्टता को समझने में महत्वपूर्ण योगदान दे सकता है।स्पोडोप्टेरा फ्रुगिपरडा (एसएफबीटाग्ली) से बीटा-ग्लाइकोसिडेज़ में, दोनों अवशेष Q39 और E451 सब्सट्रेट के साथ बातचीत करते हैं और यह सब्सट्रेट विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है।Sfbetagly (A451E39, S451E39 और S451N39) के डबल म्यूटेंट को साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन द्वारा तैयार किया गया था, बैक्टीरिया में व्यक्त किया गया और एफ़िनिटी क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके शुद्ध किया गया।इन एंजाइमों को सब्सट्रेट के रूप में पी-नाइट्रोफेनिल बीटा-गैलेक्टोसाइड और पी-नाइट्रोफिनाइल बीटा-फ्यूकोसाइड का उपयोग करके चित्रित किया गया था।Q39 और E451 स्थिति पर साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन वाले Sfbetagly के एकल और दोहरे उत्परिवर्ती के लिए k cat/Km अनुपात का उपयोग यह प्रदर्शित करने के लिए किया गया था कि दोहरे उत्परिवर्तन (Gdouble) के ESdouble डैगर (एंजाइम-संक्रमण राज्य परिसर) की मुक्त ऊर्जा पर प्रभाव पड़ता है। डैगरक्सी) एकल उत्परिवर्तन (जीडबल डैगरएक्स और जीडबल डैगरी) से उत्पन्न प्रभावों का योग नहीं है।जीडबल डैगर में यह अंतर इंगित करता है कि एकल उत्परिवर्तन के प्रभाव आंशिक रूप से ओवरलैप होते हैं।इसलिए, यह सामान्य प्रभाव Gdouble daggerxy में केवल एक बार गिना जाता है।बीटा-ग्लाइकोसिडेस पर क्रिस्टलोग्राफिक डेटा से अवशेष Q39 और E451 और सब्सट्रेट के समान हाइड्रॉक्सिल समूह से जुड़े एक बाइडेंटेट हाइड्रोजन बांड की उपस्थिति का पता चलता है।इसलिए, थर्मोडायनामिक और क्रिस्टलोग्राफिक डेटा दोनों बताते हैं कि अवशेष Q39 और E451 सब्सट्रेट के साथ उनके संबंधित इंटरैक्शन पर पारस्परिक प्रभाव डालते हैं।