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प्रोटीन फॉस्फोराइलेशन नेटवर्क की भारी जटिलता के कारण प्रोटीओम-वाइड फॉस्फोराइलेशन घटनाओं का विश्लेषण अभी भी एक प्रमुख विश्लेषणात्मक चुनौती है।इस कार्य में, हम फॉस्फोप्रोटीम के वैश्विक विश्लेषण में योगदान करने की उनकी क्षमता के संबंध में Lys-N, Lys-C और ट्रिप्सिन की संपूरकता का मूल्यांकन करते हैं।एन-टर्मिनली एसिटिलेटेड, फॉस्फोराइलेटेड और गैर-संशोधित पेप्टाइड्स को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए कम-पीएच मजबूत कटियन एक्सचेंज के एक परिष्कृत संस्करण का उपयोग किया गया था।तीन एंजाइमों के संयोजन का उपयोग करके 1 मिलीग्राम प्रोटीन से <1% की झूठी खोज दर के साथ कुल 5036 गैर-निरर्थक फॉस्फोपेप्टाइड की पहचान की जा सकती है।हमारे डेटा से पता चला कि विभिन्न प्रोटीज के साथ उत्पन्न फॉस्फोपेप्टाइड डेटा सेट के बीच ओवरलैप मामूली था, जबकि दो समान रूप से उत्पन्न ट्राइप्टिक डेटा सेट के बीच ओवरलैप कम से कम 4 गुना अधिक पाया गया था।इस तरह, Lys-N और ट्रिप्सिन के समानांतर उपयोग से अकेले ट्रिप्सिन की तुलना में पाए गए फॉस्फोपेप्टाइड्स की संख्या में 72% की वृद्धि हुई, जबकि ट्रिप्सिन प्रतिकृति प्रयोग से केवल 25% की वृद्धि हुई।इस प्रकार, जब केवल ट्रिप्सिन और लिस-एन डेटा पर ध्यान केंद्रित किया गया, तो हमने 4671 गैर-निरर्थक फॉस्फोपेप्टाइड्स की पहचान की।खोजी गई साइटों के आगे के विश्लेषण से पता चला कि लिस-एन और ट्रिप्सिन डेटा सेट काफी अलग-अलग फॉस्फोराइलेशन रूपांकनों में समृद्ध थे, जिससे यह सबूत मिलता है कि फॉस्फोप्रोटीम विश्लेषण में मल्टीप्रोटीज़ दृष्टिकोण बहुत मूल्यवान हैं।