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थाइमिडीन फ़ॉस्फ़ोरिलेज़ (टीपी, ईसी 2.4.2.4) ने आधार और राइबोसिल मोएटीज़ दोनों के माध्यम से उच्च विशिष्टता के साथ सब्सट्रेट की संरचना को पहचाना।थाइमिडीन के 3'-ओएच के प्रतिस्थापन ने टीपी के साथ इसकी उत्प्रेरक गतिविधि को स्पष्ट रूप से प्रभावित किया।संशोधित आधार भागों के साथ पाइरीमिडीन न्यूक्लियोसाइड का संबंधित 1-फॉस्फेट रूप में रूपांतरण खराब था।सक्रिय स्थल पर स्थानीय अमीनो एसिड द्वारा आधार को ध्रुवीकृत करने में बढ़ती कठिनाई के कारण, पिरिमिडीन बेस भाग की सुगंध में वृद्धि के साथ छोड़ने वाले समूह की गतिविधि में कमी आई।3' और 5' कार्यात्मक समूहों के प्रतिस्थापन से प्रतिक्रिया दर और टीपी के साथ प्रतिशत रूपांतरण में कमी आई।विशेष रूप से राइबोसिल 3' हाइड्रॉक्सिल समूह एंजाइम द्वारा सब्सट्रेट के बंधन के लिए संरचनात्मक रूप से महत्वपूर्ण था।गतिज परख ने 3' हाइड्रॉक्सिल समूह को हाइड्रोजन से बदलने पर स्पष्ट रूप से उच्च K(m) और निम्न V(अधिकतम) मान दिखाया।